La scorsa settimana abbiamo condiviso diverse considerazioni sull'uso dell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa e termineremo questo argomento qui oggi per vostro riferimento.
Selezione di Concentrazione tampone
La concentrazione del tampone utilizzata nell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa è generalmente inferiore a quella utilizzata nell'elettroforesi su carta.Il pH comunemente usato 8.6Bil tampone arbitrale viene generalmente scelto nell'intervallo compreso tra 0,05 mol/L e 0,09 mol/L.Quando si seleziona la concentrazione, viene effettuata una determinazione preliminare.Ad esempio, se la lunghezza della striscia di membrana tra gli elettrodi nella camera di elettroforesi è di 8-10 cm, è necessaria una tensione di 25 V per centimetro di lunghezza della membrana e l'intensità di corrente dovrebbe essere 0,4-0,5 mA per centimetro di larghezza della membrana.Se questi valori non vengono raggiunti o superati durante l'elettroforesi, la concentrazione del tampone deve essere aumentata o diluita.
Una concentrazione di tampone eccessivamente bassa comporterà un rapido movimento delle bande e un aumento della larghezza della banda.D'altro canto, una concentrazione eccessivamente elevata del tampone rallenterà la migrazione delle bande, rendendo difficile la distinzione di alcune bande di separazione.
Va notato che nell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa, una parte significativa della corrente viene condotta attraverso il campione, generando una notevole quantità di calore.A volte, la concentrazione del tampone scelta può essere considerata appropriata.Tuttavia, in condizioni di temperatura ambientale elevata o quando si utilizza una tensione più elevata, l'evaporazione dell'acqua dovuta al calore può intensificarsi, determinando una concentrazione eccessivamente elevata del tampone e persino provocando l'essiccazione della membrana.
Volume del campione
Nell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa, la quantità di volume del campione è determinata da vari fattori, tra cui le condizioni dell'elettroforesi, le proprietà del campione stesso, i metodi di colorazione e le tecniche di rilevamento.In linea di principio, quanto più sensibile è il metodo di rilevamento, tanto più piccolo può essere il volume del campione, il che è vantaggioso per la separazione.Se il volume del campione è eccessivo, i modelli di separazione elettroforetica potrebbero non essere chiari e anche la colorazione può richiedere molto tempo.Tuttavia, quando si analizzano quantitativamente le bande colorate separate utilizzando metodi di rilevamento colorimetrico ad eluizione, il volume del campione non deve essere troppo piccolo, poiché ciò potrebbe comportare valori di assorbanza inferiori per alcuni componenti, con conseguenti errori maggiori nel calcolo del loro contenuto.In tali casi, il volume del campione deve essere opportunamente aumentato.
In genere, il volume del campione aggiunto su ciascun centimetro della linea di applicazione del campione varia da 0,1 a 5 μL, equivalenti a una quantità di campione compresa tra 5 e 1.000 μg.Ad esempio, nell'analisi elettroforetica delle proteine sieriche di routine, il volume del campione aggiunto su ciascun centimetro della linea di applicazione generalmente non supera 1 μL, equivalente a 60-80 μg di proteine.Tuttavia, quando si analizzano lipoproteine o glicoproteine utilizzando lo stesso metodo di elettroforesi, il volume del campione deve essere aumentato di conseguenza.
In conclusione, il volume del campione più adatto dovrebbe essere selezionato in base alle condizioni specifiche attraverso una serie di esperimenti preliminari.
Selezione della soluzione colorante
Le bande separate nell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa vengono generalmente colorate prima del rilevamento.Componenti diversi del campione richiedono metodi di colorazione diversi e i metodi di colorazione adatti per l'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa potrebbero non essere del tutto applicabili alla carta da filtro.
Esistono tre principi fondamentali per cui scegliere la soluzione colorantemembrana di acetato di cellulosa.in primo luogo,I coloranti idrosolubili dovrebbero essere preferiti rispetto ai coloranti alcolsolubili per evitare il restringimento e la deformazione della membrana causati dalla soluzione colorante di questi ultimi.Dopo la colorazione è importante risciacquare la membrana con acqua e ridurre al minimo la durata della colorazione.In caso contrario, la membrana potrebbe arricciarsi o restringersi, compromettendo il successivo rilevamento.
In secondo luogo, è preferibile selezionare coloranti con forte affinità di colorazione per il campione.Nell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa delle proteine sieriche, l'ammino nero 10B è comunemente utilizzato a causa della sua forte affinità di colorazione per vari componenti delle proteine sieriche e della sua stabilità.
In terzo luogo, dovrebbero essere scelti coloranti di qualità affidabile.Alcuni coloranti, pur avendo lo stesso nome, possono contenere impurità che risultano in uno sfondo particolarmente scuro dopo la colorazione.Ciò può persino offuscare le bande originariamente ben separate, rendendole difficili da distinguere.
Infine, è importante la scelta della concentrazione della soluzione colorante.In teoria, potrebbe sembrare che una concentrazione più elevata della soluzione colorante possa portare a una colorazione più accurata dei componenti del campione e a risultati di colorazione migliori.Tuttavia, questo non è il caso.L'affinità di legame tra i componenti del campione e il colorante ha un certo limite, che non aumenta con l'aumento della concentrazione della soluzione colorante.Al contrario, una concentrazione eccessiva della soluzione colorante non solo spreca il colorante ma rende anche difficile ottenere uno sfondo chiaro.Inoltre, quando l'intensità del colore raggiunge un certo valore massimo, la curva di assorbanza del colorante non segue una relazione lineare, soprattutto nelle misurazioni quantitative. Nell'elettroforesi su membrana di acetato di cellulosa, la concentrazione della soluzione colorante è generalmente inferiore a quella utilizzata nell'elettroforesi su carta.
Dettagli da sapere sulla biotecnologia Liuyi di Pechino's membrana di acetato di cellulosaserbatoio di elettroforesi e la sua applicazione di elettroforesi, visitare qui:
lEsperimento per la separazione delle proteine sieriche mediante membrana in acetato di cellulosa
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Riferimento:Elettroforesi (seconda edizione) del signor Li
Orario di pubblicazione: 06-giu-2023