L'elettroforesi su gel è uno dei principali metodi utilizzati in biologia molecolare per l'analisi del DNA.Questo metodo prevede la migrazione di frammenti di DNA attraverso un gel, dove vengono separati in base alla dimensione o alla forma.Tuttavia, hai mai riscontrato errori durante i tuoi esperimenti di elettroforesi, come bande macchiate sul gel di agarosio o assenza di bande sul gel?Quale potrebbe essere la causa di questi errori?
I nostri tecnici hanno riepilogato qui le coppie di soluzioni per la risoluzione dei problemi come riferimento.
1. Bande spalmate su gel di agarosio
●Il DNA è stato degradato.Evitare la contaminazione da nucleasi.
● Il tampone dell'elettroforesi non è fresco.Dopo l'uso ripetuto del tampone per elettroforesi, la forza ionica diminuisce e il suo valore di pH aumenta, quindi la capacità del tampone si indebolisce, influenzando l'effetto dell'elettroforesi.Si consiglia di sostituire frequentemente il tampone dell'elettroforesi.
● Sono state utilizzate condizioni di elettroforesi inadeguate.Non consentire che la tensione superi i 20 V/cm e mantenere una temperatura <30° C durante l'elettroforesi.Per l'elettroforesi del filamento di DNA gigante, la temperatura dovrebbe essere <15° C. Controllare che il tampone dell'elettroforesi abbia una capacità tampone sufficiente.
● Sul gel è stato caricato troppo DNA.Diminuire la quantità di DNA.
● Troppo sale nel DNA.Utilizzare la precipitazione con etanolo per rimuovere i sali in eccesso in anticipo.
● Il DNA era contaminato da proteine.Utilizzare le estrazioni fenoliche per rimuovere le proteine in fase avanzata.
● Il DNA è stato denaturato.Non riscaldare prima dell'elettroforesi.Diluire il DNA in tampone con 20 mM NaCl.
2. Anomalie nella migrazione della banda del DNA
● Rinaturazione del sito COS del frammento λHind III.Riscaldare il DNA per 5 minuti a una temperatura di 65° C prima dell'elettroforesi, quindi raffreddarlo sull'unità di ghiaccio per 5 minuti.
● Sono state utilizzate condizioni di elettroforesi inadeguate.Non consentire che la tensione superi i 20 V/cm e mantenere una temperatura <30° C durante l'elettroforesi.Verificare che il buffer dell'elettroforesi abbia una capacità tampone sufficiente.
● Il DNA è stato denaturato.Non riscaldare prima dell'elettroforesi.Diluire il DNA in tampone con 20 mM NaCl.
3. Bande di DNA deboli o assenti sul gel di agarosio
● La quantità o la concentrazione di DNA caricato sul gel era insufficiente.Aumentare la quantità di DNA.L'elettroforesi su gel di poliacrilammide è leggermente più sensibile dell'elettroforesi di agarosio e il caricamento del campione può essere ridotto in modo appropriato.
● Il DNA è stato degradato.Evitare la contaminazione da nucleasi.
● Il DNA è stato separato mediante elettroforesi dal gel.Eseguire l'elettroforesi del gel per meno tempo, utilizzare una tensione inferiore o utilizzare una percentuale di gel più elevata.
● Per la visualizzazione del DNA colorato con bromuro di etidio è stata utilizzata una sorgente luminosa W non corretta.Utilizzare una luce W a lunghezza d'onda corta (254 nm) per una maggiore sensibilità.
4. Bande di DNA mancanti
●Il DNA di piccole dimensioni è stato sottoposto a elettroforesi dal gel.Eseguire l'elettroforesi del gel per meno tempo, utilizzare una tensione inferiore o utilizzare una percentuale di gel più elevata.
● Difficile distinguere le bande di DNA di dimensioni molecolari simili.Aumentare il tempo dell'elettroforesi e controllare la concentrazionedel gel per assicurarsi che venga utilizzata la percentuale corretta di gel.
● Il DNA è stato denaturato.Non riscaldare prima dell'elettroforesi.Diluire il DNA in tampone con 20 mM NaCl.
● I filamenti di DNA sono enormi e l'elettroforesi su gel convenzionale non è adatta.Analizzare sull'elettroforesi su gel a impulsi.Quali altri problemi hai avuto con l'elettroforesi su gel di agarosio?Faremo ulteriori ricerche per le guide in futuro.
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Orario di pubblicazione: 09-maggio-2022