L'elettroforesi su gel è uno dei principali metodi utilizzati in biologia molecolare per l'analisi del DNA. Questo metodo prevede la migrazione di frammenti di DNA attraverso un gel, dove vengono separati in base alla dimensione o alla forma. Tuttavia, hai mai riscontrato errori durante i tuoi esperimenti di elettroforesi, come bande macchiate sul gel di agarosio o assenza di bande sul gel? Quale potrebbe essere la causa di questi errori?
I nostri tecnici hanno riepilogato qui le coppie di soluzioni per la risoluzione dei problemi come riferimento.
1. Bande spalmate su gel di agarosio
●Il DNA è stato degradato. Evitare la contaminazione da nucleasi.
● Il tampone dell'elettroforesi non è fresco. Dopo l'uso ripetuto del tampone per elettroforesi, la forza ionica diminuisce e il suo valore di pH aumenta, quindi la capacità del tampone si indebolisce, influenzando l'effetto dell'elettroforesi. Si consiglia di sostituire frequentemente il tampone dell'elettroforesi.
● Sono state utilizzate condizioni di elettroforesi inadeguate. Non consentire che la tensione superi i 20 V/cm e mantenere una temperatura <30° C durante l'elettroforesi. Per l'elettroforesi del filamento di DNA gigante, la temperatura dovrebbe essere <15° C. Controllare che il tampone dell'elettroforesi abbia una capacità tampone sufficiente.
● Sul gel è stato caricato troppo DNA. Diminuire la quantità di DNA.
● Troppo sale nel DNA. Utilizzare la precipitazione con etanolo per rimuovere i sali in eccesso in anticipo.
● Il DNA era contaminato da proteine. Utilizzare le estrazioni fenoliche per rimuovere le proteine in fase avanzata.
● Il DNA è stato denaturato. Non riscaldare prima dell'elettroforesi. Diluire il DNA in tampone con 20 mM NaCl.
2. Anomalie nella migrazione della banda del DNA
● Rinaturazione del sito COS del frammento λHind III. Riscaldare il DNA per 5 minuti a una temperatura di 65° C prima dell'elettroforesi, quindi raffreddarlo sull'unità di ghiaccio per 5 minuti.
● Sono state utilizzate condizioni di elettroforesi inadeguate. Non consentire che la tensione superi i 20 V/cm e mantenere una temperatura <30° C durante l'elettroforesi. Verificare che il buffer dell'elettroforesi abbia una capacità tampone sufficiente.
● Il DNA è stato denaturato. Non riscaldare prima dell'elettroforesi. Diluire il DNA in tampone con 20 mM NaCl.
3. Bande di DNA deboli o assenti sul gel di agarosio
● La quantità o la concentrazione di DNA caricato sul gel era insufficiente. Aumentare la quantità di DNA. L'elettroforesi su gel di poliacrilammide è leggermente più sensibile dell'elettroforesi di agarosio e il caricamento del campione può essere ridotto in modo appropriato.
● Il DNA è stato degradato. Evitare la contaminazione da nucleasi.
● Il DNA è stato separato mediante elettroforesi dal gel. Eseguire l'elettroforesi del gel per meno tempo, utilizzare una tensione inferiore o utilizzare una percentuale di gel più elevata.
● Per la visualizzazione del DNA colorato con bromuro di etidio è stata utilizzata una sorgente luminosa W non corretta. Utilizzare una luce W a lunghezza d'onda corta (254 nm) per una maggiore sensibilità.
4. Bande di DNA mancanti
●Il DNA di piccole dimensioni è stato sottoposto a elettroforesi dal gel. Eseguire l'elettroforesi del gel per meno tempo, utilizzare una tensione inferiore o utilizzare una percentuale di gel più elevata.
● Difficile distinguere le bande di DNA di dimensioni molecolari simili. Aumentare il tempo dell'elettroforesi e controllare la concentrazionedel gel per assicurarsi che venga utilizzata la percentuale corretta di gel.
● Il DNA è stato denaturato. Non riscaldare prima dell'elettroforesi. Diluire il DNA in tampone con 20 mM NaCl.
● I filamenti di DNA sono enormi e l'elettroforesi su gel convenzionale non è adatta. Analizzare sull'elettroforesi su gel a impulsi.Quali altri problemi hai avuto con l'elettroforesi su gel di agarosio? Faremo ulteriori ricerche per le guide in futuro.
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Orario di pubblicazione: 09-maggio-2022