Preparazione di un gel di agarosio per l'elettroforesi

Preparazione del gel di agarosio per l'elettroforesi

Nota: indossare sempre guanti monouso!

Istruzioni passo passo

Pesatura della polvere di agarosio:uutilizzare carta per pesare e una bilancia elettronica per misurare 0,3 g di polvere di agarosio (basato su un sistema da 30 ml).

Preparazione del buffer TBST:priparare 30 ml di tampone TBST 1x in una beuta Erlenmeyer da 100 ml.

Dissoluzione della polvere di agarosio:pVersare la polvere di agarosio nel tampone TBST e agitare bene.Mettili dentronel microonde e scaldare (in genere per 50 secondi, coperto con un foglio di alluminio) fino a completa dissoluzione.

Raffreddamento e aggiunta di nucleasi:uUtilizzare dei guanti per togliere il composto dal microonde e lasciarlo raffreddare leggermente in acqua fredda finché non sarà tiepido (circa 60°C). Aggiungere 2 µl di nucleasi (sostituto dell'Eb) agitando per mescolare accuratamente.

Preparazione dello stampo in gel:

• Cappoggiare e asciugare ilvassoio del gel e dispositivo di colata del geldella vasca di elettroforesi.
•  Pallacciare il gelvassoionel serbatoio interno e inserire il pettine in una posizione fissa.
• Mescolare la soluzione di gel di agarosio, raffreddata a circa 65°C, e versarla con attenzione sulvassoio del gelneldispositivo per la fusione del gel, stendendolo lentamente fino a formare uno strato uniforme di gel sulla lastra di vetro.
• Lasciarlo riposare a temperatura ambiente finché il gel non si solidifica completamente.
• Rimuovere delicatamente il pettine verticalmente e rimuovere il nastro.
• Posiziona il gelvassoionel serbatoio dell'elettroforesi.

Importante: assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella zona dei denti del pettine. La superficie del liquido dovrebbe essere liscia senza increspature.

Esecuzione del gel

Caricamento del gel

Dopo che il gel si è solidificato, posizionarlo nel serbatoio dell'elettroforesi e versare il tampone dell'elettroforesi fino a quando il gel non viene sommerso.

Preparazione dei campioni

• Prendere il pennarello e il tampone di caricamento dal frigorifero.
• Aggiungere 6 µl di tampone di caricamento ai campioni e mescolare bene.
• Utilizzando una micropipetta, caricare lentamente i campioni nei pozzetti grandi del gel (fare attenzione a non forare il gel e non erogare l'intero volume per evitare bolle d'aria).
• Caricare il marcatore in uno qualsiasi dei pozzetti piccoli (ricordare la sua posizione).

Inizio dell'elettroforesi

• Coprire il serbatoio dell'elettroforesi e avviare l'elettroforesi immediatamente dopo aver caricato il gel.
• Impostare la tensione su 60-100 V. I campioni migreranno dall'elettrodo negativo (nero) all'elettrodo positivo (rosso).
• Una tensione più elevata riduce l'intervallo di separazione effettiva del gel di agarosio.
• Interrompere l'elettroforesi quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge circa 1 cm dal bordo inferiore della piastra di gel.

Osservazione dei risultati

Dopo aver separato le bande, interrompere l'elettroforesi, estrarre il gel e rilevarlo e fotografarlo direttamente.

Utilizzare un sistema di imaging su gel per fotografare e osservare le bande (controllare se sono presenti bande per il marcatore o i campioni).

Dopo aver ottenuto la mappa della banda di gel, trova l'indicatore. In base al marker è possibile determinare le bande target!

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