Preparazione del campione eCaricamento
A causa dell'uso di un sistema tampone continuo senza gel di impilamento, nella maggior parte dei casi, i campioni dovrebbero avere una concentrazione adeguata e un volume ridotto. Utilizzare apipettaaggiungere lentamente il campione, con 5-10 μg per pozzetto, per evitare una diminuzione significativa della risoluzione. Quandocaricamento del campione, l'alimentazione deve essere disattivata. Il campione deve contenere un colorante indicatore (0,025% blu di bromofenolo o arancione) e saccarosio (10-15%) o glicerolo (5-10%) per aumentarne la densità, concentrare il campione e prevenirne la diffusione. Tuttavia, a volte il saccarosio o il glicerolo possono causare bande a forma di U nei risultati dell'elettroforesi, cosa che può essere evitata utilizzando Ficoll al 2,5% (polivinilpirrolidone).
Elettroforesi
La tensione per l'elettroforesi è 5-15 V/cm, generalmente intorno a 10 V/cm. Per la separazione di molecole di grandi dimensioni, la tensione dovrebbe essere inferiore, solitamente non superiore a 5 V/cm.
Colorazione
Il colorante fluorescente bromuro di etidio (EB) è comunemente usato per la colorazione per osservare le bande di DNA nel gel di agarosio. L’EB può inserirsi tra coppie di basi di molecole di DNA, facendo sì che l’EB si leghi al DNA. L'assorbimento della luce ultravioletta a 260 nm da parte del DNA viene trasferito all'EB e l'EB legato emette fluorescenza a 590 nm nella regione rosso-arancione dello spettro della luce visibile. Colorando il gel in una soluzione di MgSO4 da 1 mmol/L per 1 ora è possibile ridurre la fluorescenza di fondo causata dall'EB non legato, facilitando il rilevamento di piccole quantità di DNA.
Il colorante EB presenta numerosi vantaggi: è facile da usare, non rompe gli acidi nucleici, ha un'elevata sensibilità e può colorare sia il DNA che l'RNA. L'EB può essere aggiunto al campione e tracciato utilizzando l'assorbimento UV in qualsiasi momento. Dopo la colorazione, l'EB può essere rimosso mediante estrazione con n-butanolo.
Tuttavia, il colorante EB è un potente mutageno e durante la manipolazione è necessario adottare precauzioni, come indossare guanti di polietilene. Anche l'arancio di acridina è un colorante comunemente usato perché può distinguere tra acidi nucleici a filamento singolo e a doppio filamento (DNA, RNA). Presenta una fluorescenza verde (530 nm) per gli acidi nucleici a doppio filamento e una fluorescenza rossa (640 nm) per gli acidi nucleici a filamento singolo. Inoltre, per la colorazione è possibile utilizzare altri coloranti come il blu di metilene, il verde di metilene e la chinolina B.
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Orario di pubblicazione: 20 dicembre 2023