1. Classificazione
L'elettroforesi su gel è divisa in tipi verticali (compresi gel a colonna e gel a lastre) e tipi orizzontali (principalmente gel a lastre) (Figura 6-18). Generalmente, la separazione verticale è leggermente superiore a quella orizzontale, ma la preparazione del gel orizzontale presenta almeno quattro vantaggi: c'è un supporto sotto l'intero gel, consentendo l'uso di agarosio a bassa concentrazione; è possibile preparare piastre di gel di agarosio con specifiche diverse; la preparazione del gel e il caricamento del campione sono più convenienti; la camera per elettroforesi è facile da costruire ed economica. Poiché l'elettroforesi orizzontale viene eseguita con la piastra di gel di agarosio completamente immersa a circa 1 mm sotto la superficie del tampone di elettroforesi, viene anche chiamata elettroforesi sommersa.
Serbatoio per elettroforesi DYCP-31DN per elettroforesi su gel di agarosio
2.Sistema buffer
Nella separazione degli acidi nucleici, la maggior parte dei sistemi adotta sistemi continui. I tamponi per elettroforesi comunemente usati includono il tampone TBE (0,08 mol/L Tris·HCl, pH 8,5, 0,08 mol/L acido borico, 0,0024 mol/L EDTA) e il tampone THE (0,04 mol/L Tris·HCl, pH 7,8, 0,02 mol/L tampone di acetato di sodio, 0,0018mol/L EDTA). Questi tamponi vengono generalmente preparati come soluzioni madre 10x e diluiti alla concentrazione richiesta durante l'uso. Le velocità di migrazione del DNA lineare e circolare nel gel di agarosio variano a seconda del tampone utilizzato. Nel buffer THE, la velocità di migrazione del DNA lineare è maggiore di quella del DNA circolare, mentre nel buffer TBE è vero il contrario.
3.Preparazione del gel di agarosio
(1) Preparazione del gel di agarosio orizzontale
(a) Preparare la concentrazione richiesta di gel di agarosio utilizzando 1x tampone per elettroforesi.
(b) Riscaldare l'agarosio fino a completa dissoluzione in un bagno d'acqua bollente, su un agitatore magnetico o nel microonde. Raffreddare la soluzione di agarosio a 55°C e aggiungere il colorante di bromuro di etidio (EB) ad una concentrazione finale di 0,5 μg/ml.
(c) Sigillare i bordi delle piastre di vetro o acriliche con una piccola quantità di gel di agarosio, aggiungere un pettine e posizionare i denti del pettine a circa 0,5~1,0 mm sopra la piastra.
(d) Versare continuamente la soluzione di gel di agarosio fuso nello stampo in vetro o acrilico (lo spessore dipende dal volume del campione di DNA), evitando l'introduzione di bolle d'aria. Lasciarlo solidificare naturalmente a temperatura ambiente.
(e) Rimuovere con attenzione il pettine dopo la completa solidificazione. Aggiungere una quantità adeguata di tampone di elettroforesi al serbatoio del gel, assicurandosi che la piastra di gel sia immersa a circa 1 mm sotto la superficie del tampone di elettroforesi.
(2) Preparazione del gel di agarosio verticale
(a) Rimuovere grasso o residui dalle lastre di vetro lavandole con etanolo.
(b) Posizionare le piastre distanziatrici tra le dighe anteriori e posteriori, allineare i bordi delle piastre distanziatrici con le dighe anteriori e posteriori e fissarle con i morsetti.
(c) Aggiungere il 2% di agarosio in tampone 1x tra i bordi delle piastre distanziatrici per formare un tappo di agarosio alto 1 cm sul fondo della camera di colata del gel.
(d) Versare il gel di agarosio fuso alla concentrazione desiderata, preparato in tampone 1x, nella camera del gel fino a 1 cm sotto la parte superiore.
(e) Inserire il pettine, evitando di intrappolare bolle d'aria sotto i denti del pettine. A volte possono comparire delle rughe sui denti del pettine durante il raffreddamento del gel di agarosio; in questi casi è sufficiente aggiungere un po' di agarosio fuso in cima per solidificarlo.
(f) Rimuovere il pettine. Per evitare perdite di buffer nello slot di caricamento, sigillare la connessione tra la piastra di gel di agarosio e la camera di elettroforesi con agarosio al 2% e aggiungere la quantità necessaria di buffer.
(g) Aggiungere 1 tampone per elettroforesi alla camera del gel.
(h) Caricare con attenzione i campioni di DNA sul gel di agarosio sotto il buffer.
Maggiori informazioni sulle conoscenze di base sull'elettroforesi su gel di agarosio saranno condivise la prossima settimana. Desideri che queste informazioni siano utili per il tuo esperimento.
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Orario di pubblicazione: 07-dic-2023